糖代谢紊乱与糖尿病、肥胖、脂肪肝以及多种心血管疾病的发生发展密切相关。探索改善糖代谢异常的有效策略是当前的研究热点之一。肠道L细胞分泌的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）能通过刺激胰岛素分泌参与血糖调控，但其在肠道中会迅速被二肽基肽酶IV（DPP-IV）降解。
目前，从天然食物蛋白资源中挖掘具有DPP-IV抑制活性的生物活性肽已成为备受关注的重要策略。然而，许多天然蛋白资源缺乏基因组和蛋白质组信息，阻碍了新型DPP-IV抑制肽的高效发掘。传统方法存在工作量大、周期长、成本高等问题。因此，如何建立高通量集成挖掘技术，从天然蛋白资源中发现可用于功能性食品和肽类药物开发的DPP-IV抑制肽，仍面临重大挑战。
近日，清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程研究院邢新会教授团队在iMeta（IF 33.2）发表题为Discovery of a novel tetrapeptide as glucose homeostasis modulator with bifunctionalities of targeting DPP-IV and microbiota（新型四肽通过抑制DPP-IV以及调节肠道菌群改善糖代谢）的文章。团队通过采用分子对接、机器学习、酶组学、蛋白质组学技术结合肠道类器官模型构建了基于DPP-IV抑制的高通量多肽筛选体系，首次挖掘了具有DPP-IV抑制能力的活性多肽VAMP并解析了其对肠道菌群的调控作用，为天然生物活性肽的发掘及血糖紊乱干预提供了新视角。
图 1 基于团队构建的多组学、分子对接、机器学习及肠道类器官模型的DPP-IV抑制活性肽的高通量筛选方法体系构建
首先，研究采用多种酶水解策略结合体外/体内功能验证，系统筛选了火麻仁蛋白（HSP）中具有DPP-IV抑制活性的功能性酶解产物（图2A）。测定结果显示，其中thermolysin酶解产物（TPH）表现出最强的DPP-IV抑制活性，并能显著提升肠道类器官中活性GLP-1水平（图2B-F）。进一步的动物实验证实，TPH干预可显著改善肥胖相关指标，提高血浆总GLP-1及活性GLP-1水平、增强葡萄糖耐量、降低胰岛素抵抗，这些结果证实TPH可通过抑制DPP-IV改善糖代谢。进一步通过分子对接与机器学习虚拟筛选相结合的策略，并辅以体外活性验证，系统挖掘了其中的关键活性肽序列（图2G）。结果表明四肽VAMP表现出最强的DPP-IV抑制能力（图2H-M）。进一步模拟胃肠消化实验表明，仅VAMP、FPQS和YNLP能耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的降解（图2N），并且VAMP在TPH中的含量最为丰富，占比0.5%左右。VAMP与DPP-IV作用动力学解析结果显示，VAMP是通过竞争性结合抑制DPP-IV活性（图2O），共晶结构解析发现，VAMP与DPP-IV活性中心的ARG125、GLU205等8个残基形成氢键，并与ARG125等3个位点建立盐桥，该结果与分子对接模拟高度一致（图2P-Q）。此外，VAMP能以剂量依赖方式抑制DPP-IV活性并提升活性GLP-1水平（图2R-S）。
图2 火麻仁蛋白酶解产物中DPP-IV抑制肽的挖掘
团队进一步评估了VAMP在糖代谢异常小鼠中的作用效果。研究发现，VAMP干预显著提升了肠道和循环中活性GLP-1水平，并有效改善了糖代谢和胰岛素抵抗图3A-H）。同时，团队发现VAMP干预可显著增强肠道屏障完整性，并缓解代谢性内毒素血症（图3I-O）。在ob/ob肥胖小鼠模型中，VAMP同样可以通过抑制肠道DPP-IV改善糖代谢。这些结果表明，VAMP通过抑制肠道DPP-IV活性和改善肠道屏障功能，改善糖代谢紊乱（图3P-U）。进一步的体外实验探究VAMP对肠道菌群的影响。首先，通过药代动力学分析，我们发现VAMP口服生物利用度为10.54%，在其血药浓度达到峰值时仍有74.18%的VAMP存在于肠道内容物中（图3P-Q），表明除了抑制肠道DPP-IV活性外，VAMP可能通过直接作用于肠道菌群发挥调控作用。进一步研究证实VAMP可被菌群降解，同时显著促进A. muciniphila增殖。单菌培养实验也证实VAMP能特异性促进A. muciniphila、Bacteroides uniformis和Lactiplantibacillus pentosus的生长（图3V），并且A. muciniphila也能够降解VAMP。进一步通过转录组测序分析发现VAMP处理显著富集了肽聚糖生物合成通路。其中，编码转糖基酶结构域蛋白的基因J4O16_RS10715（K05366）表达上调，该基因与细菌细胞壁合成有关（图3W-Z）。特异性的A. muciniphila清除模型实验显示虽然VAMP干预显著增加了A. muciniphila的丰度，但苄达明干预能显著抑制A. muciniphila增殖。VAMP的降糖效应和肠道屏障改善作用在苄达明叠加后完全消失。这些结果表明VAMP对A. muciniphila的促进是VAMP发挥糖代谢改善的另一重要途径。
图3 VAMP抑制肠道DPP-IV并促进阿克曼菌增殖
总之，研究建立的整合筛选方法为生物活性肽挖掘提供了新范式。新发现的火麻仁来源四肽VAMP通过抑制DPP-IV活性和特异性促进阿克曼氏菌增殖的双重机制改善糖代谢，为开发基于天然活性肽的降糖干预策略提供了理论依据和可靠方法。
清华大学深圳国际研究生院生物医药与健康工程研究院助理研究员陈海红为第一作者，邢新会教授为通讯作者。研究得到国家自然科学青年基金、深圳市科创委面上项目、广东省基础与应用基础研究基金自然科学面上项目、深圳市可持续发展专项、河池市科学技术局重点研发计划项目支持。
原文链接：https://doi.org/10.1002/imt2.70072
供稿：邢新会课题组
审核：陈超群、耿洪亚
